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T7 RNA聚合酶

T7 RNA聚合酶

1. 產(chǎn)品描述

作為生物大分子,mRNA 只能通過體外轉(zhuǎn)錄(IVTin vitro transcription)的方法大規(guī)模合成,T7 啟動子是目前轉(zhuǎn)錄效率***的啟動子之一,因此采用 T7 RNA 聚合酶(T7 RNA Polymerase)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄可獲得更多的合成產(chǎn)物。本制品 T7 RNA PolymeraseT7 RNA 聚合酶)為噬菌體 T7 DNA 編碼的酶,是一種高度特異識別 T7 啟動子序列的 DNA 依賴的 5'→3' RNA 聚合酶,以含有 T7 啟動子序列的單鏈或雙鏈 DNA 為模板,以 NTP 為底物,合成與 DNA 中一條鏈互補(bǔ)的 RNAT7 RNA 聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)治療用 mRNA 的關(guān)鍵酶。本品為利用大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)的 GMP 級重組 T7 RNA 聚合酶,采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn),并嚴(yán)格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留等,符合GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。

2. 質(zhì)量要求

項(xiàng)目

標(biāo)準(zhǔn)

外觀

應(yīng)為澄明液體

可見異物

不超過3/

裝量

不低于4mL/

鑒別(SDS-Page

應(yīng)與參比品條帶一致

蛋白濃度(RP外標(biāo)法)

應(yīng)為標(biāo)識濃度的±10%

pH

7.9±0.5

細(xì)菌內(nèi)毒素

10EU/mL

非特異性核酸酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性

核酸內(nèi)切酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性

核酸外切酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性

RNA酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應(yīng)為陰性

HCP殘留

50ng/ mg

HCD殘留

100pg/ mg

鎳鹽殘留

10ppm

重金屬殘留

10ppm

純度(SEC-HPLC

95.0%

純度(RP-HPLC

95.0%

活性

應(yīng)不低于50KU/mL;

微生物限度

應(yīng)不高于1CFU/1mL

3. 遵循生產(chǎn)規(guī)范

1-《GMP 附錄-細(xì)胞治療產(chǎn)品》***藥品監(jiān)督管理局。
2-《人用基因治療總論-中國藥典2020》***藥典委。
3- USP Chapter , Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細(xì)胞治療,基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。
4- USP Chapter , Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中細(xì)胞因子和生長因子。
5- Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生產(chǎn)細(xì)胞或基因治療藥物的生物來源原料。

4. 產(chǎn)品基本信息

來源

攜帶噬菌體 T7 DNA 基因的 E. coli

儲存緩沖液

50 mM Tris-HCl (pH 7.9);100 mM NaCl;10mM DTT;1 mM EDTA;0.1% Triton X-100;50% (v/v) Glycerol

儲存條件

-20±5

5. 產(chǎn)品特點(diǎn)

5.1更好的酶活

通過定點(diǎn)突變技術(shù),對 T7 啟動子有高度特異性。相同完整率下,遠(yuǎn)高于市售主流競品的產(chǎn)率。

RNA生成量(μg

時間(min

KK市售產(chǎn)品

樂布斯產(chǎn)品

180

64.8

97.8

150

65.3

95.1

120

59

93.6

90

57.1

91.1

60

55.5

86.7

30

43.6

67.4

10

24.9

61.6

KK競品對比測試,在3h反應(yīng)時間下產(chǎn)量提升50.9%

樣品名稱

濃度μg/μL

A260/A280

A260/A230

***終mRNA溶液體積

IVT反應(yīng)體系

折算產(chǎn)率

樂布斯產(chǎn)品 200U/μl

1783.9

1.97

2.16

0.5mL

100μL

8.92mg/mL

ZW市售產(chǎn)品 200U/μl

1400.3

1.94

2.14

0.5mL

100μL

7.00mg/mL

ZW競品對比測試,在3h反應(yīng)時間下產(chǎn)量提升27.4%

5.2.更好的 凍融穩(wěn)定性

37 24h、凍融5次條件下,樣品穩(wěn)定。

5.3.完善嚴(yán)苛的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

獨(dú)立的SEC-HPLC分析方法開發(fā) RP-HPLC 分析方法開發(fā)

6. 產(chǎn)品用途

1- 合成單鏈 RNA,用于 mRNA 疫苗等制備。

2- 合成高特異性 RNA 探針。

3- 合成 siRNA 前體。

4- 制作 RNA 剪接反應(yīng)(RNA splicing)的前體。

5- 利用帽類似物合成帶帽 RNA

7. 產(chǎn)品包裝

1- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (50U/μl)。

2- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (200U/μl)

3- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (可定制規(guī)格)。

8. 注意事項(xiàng)

1- 模板效率和孵化時間: 不同模板的產(chǎn)量會因模板的序列、結(jié)構(gòu)、長度、純度以及特定 RNA 聚合酶啟動子的序列和長度而有所不同。影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量的污染物包括核糖核酸酶或污染物,如苯酚、微量金屬和 SDS。

2- 優(yōu)化的反應(yīng)推薦的反應(yīng)條件可適用于大多數(shù)模板的體外轉(zhuǎn)錄,但是,對于某些模板,可以通過延長反應(yīng)時間(4 小時-過夜反應(yīng)), 增加模板的用量來提高產(chǎn)率。

3- 保持 RNase-free 環(huán)境:使用無 RNase 管和移液槍;處理含有 RNA 的試劑盒組件或樣品時應(yīng)戴手套,并經(jīng)常更換手套,特別是接觸到 RNase 的潛在污染源,如門把手、 鋼筆、鉛筆和人體皮膚后。不使用時,應(yīng)將所有試劑密封好。在孵育過程中,將所有含有 RNA 的試管密封。

4- 在配置反應(yīng)體系時,可以加入 適當(dāng)?shù)?span style=";padding: 0px;border: 0px;list-style: none">RNase 抑制劑。

5- 由于配套 Transcription Buffer 內(nèi)的成分濃度偏高,高鹽環(huán)境會導(dǎo)致聚合酶失活,同時 buffer 中含其它多種成分物質(zhì),可能會與模板 DNA 形成沉淀,配制反應(yīng)液時需調(diào)整組分加樣順序,計算好體系,先加水,然后加 Buffer,NTP,***加模板和酶,以防止反應(yīng)buffer中的高濃度鹽離子對酶造成影響。

9. 模板制備

帶有雙鏈 T7 啟動子的線性化質(zhì)粒、PCR 產(chǎn)物或者合成的 DNA 片段都可以作為 T7 RNA Polymerase 體外轉(zhuǎn)錄模板,模板可用TE 緩沖液或 RNase-free Water 溶解。

1- 質(zhì)粒模板(建議每個反應(yīng)加 1μg 線性化質(zhì)粒作為模板)帶 T7 啟動子的質(zhì)粒可以作為轉(zhuǎn)錄模板,質(zhì)粒的線性化和純度會影響轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)量及 RNA 的完整性。環(huán)狀質(zhì)粒由于沒有有效的終止,會轉(zhuǎn)錄出不同長度的 RNA 產(chǎn)物,為了得到特定長度的 RNA,質(zhì)粒必須完全線性化,線性化的質(zhì)粒請確保雙鏈為平末端或編碼鏈 5‘端為突出結(jié)構(gòu)。

2- PCR 產(chǎn)物模板(建議每個反應(yīng)加 0.1μg~1μg 作為模板)  T7 啟動子的 PCR 產(chǎn)物可以作為體外轉(zhuǎn)錄模板。PCR 擴(kuò)增模板時將 T7 啟動子加在有義鏈的上游引物的 5’端。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后作為模板。

3- 合成的 DNA 模板(建議每個反應(yīng)加 0.1μg~0.5μg 作為模板) 合成的帶有 T7 啟動子的 DNA 片段也可以作為體外轉(zhuǎn)錄的模板。

10. 體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)流程

1- 將各組分融化后分別混勻,短暫離心收集于管底,冰上儲存?zhèn)溆谩?/span>

2- 加入以下各組分:

組分

加入量

Transcription Buffer

2 ul

ATP/GTP/CTP/UTP Mix

Each 2mM

Template DNA

20ng-1μg

T7 RNA Polymerase

50 U

RNase Free Wate

Up to 20 ul

注:根據(jù)實(shí)際情況可以在反應(yīng)體系中可添加 RNase Inhibitor  1U/μl,防止實(shí)驗(yàn)過程環(huán)境中RNase 污染。模板 DNA 應(yīng)為 RNaseA-Free、高純度,建議 OD260/280  1.8~2.0。

3- 用移液器輕輕混勻各組分,并短暫離心收集,37℃孵育 2-3 h。 為避免蒸發(fā)對反應(yīng)體系的影響,建議在 PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)。可根據(jù)產(chǎn)物片段大小適當(dāng)?shù)恼{(diào)整反應(yīng)時間,如合成小于 0.3 kb  RNA,可將反應(yīng)延長至 4 h 或更長時間,16 h 過夜反應(yīng)不會影響產(chǎn)物的質(zhì)量。

4- 在反應(yīng)體系中加入 1μl  DNase I ,37℃孵育 15 min,消化轉(zhuǎn)錄的 DNA 模板。相對于產(chǎn)物 RNA,模板 DNA 的含量非常低,一般不用去除,也可以用 DNase I 消化。

5- 合成的 RNA 經(jīng)電泳分析、純化后,可用于下游實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)物濃度極高,需用 RNase-free Water 稀釋后再檢測。



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